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Tecnicas de Genotipado

Las técnicas de genotipado permiten diferenciar a indivíduos de la misma especie analizando las regiones polimórficas del genoma. En los seres humanos gran parte de los polimorfismos se concentran en los telómeros o extremos de los cromosomas, en forma de repeticiones de ADN que se conocen como STRs (Short Tandem Repeats). Cada marcador STR ocupa una posición determinada en su cromosoma (un lugar único o locus en la secuencia del ADN cromosómico) y tiene una serie de variantes, las variantes alélicas o alelos.

Al igual que con otros genes, cada persona porta dos alelos -uno materno y otro paterno- de cada marcador STR. Excepto en el caso de gemelos monozigóticos, cada individuo recibe una combinación de alelos única de sus progenitores: durante la formación de gametos el ADN cromosómico recombina de manera diferente cada vez. Por esa razón no hay dos personas iguales en el mundo. El estudio de marcadores STR permite reducir el número de loci que se analizan en el ADN para encontrar diferencias genéticas entre dos indivíduos

Marcadores empleados para genotipado

STRs

Los marcadores STR se originan por la repetición en tándem de un número corto de nucleótidos, generalmente entre 4 y 6. La variación en el número de repeticiones produce alelos de diferente tamaño. Para cada marcador existe un número determinado de alelos de frecuencia conocida en los distintos grupos poblacionales. Aunque dos personas no emparentadas coincidan en uno o varios alelos, cuantos más alelos se analicen la probabilidad de coincidir en todos ellos se va haciendo cada vez menor.

SNPs

Identifican polimorfismos puntuales en un sólo nucleótido. Se pueden emplear para genotipado y estudio de ancestros pero tienen más valor en diagnóstico genético.

Otros marcadores


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Tecnologías

PCR

Desde el descubrimiento de la PCR (Polymerase Chain Reaction) las técnicas genéticas han experimentado un enorme progreso. El genoma de un individuo puede contener muchísima información, pero sólo una parte muy pequeña se analiza durante el genotipado. Mediante el diseño de sondas de oligonucleótidos específicas (cebadores o primers) la reacción de síntesis de la polimerasa se dirige hacia las regiones del ADN donde se sitúan los marcadores STR. La polimerasa amplifica estas regiones en ciclos sucesivos en los que la doble hebra de ADN se desnaturaliza y se replica. Se generan fragmentos de ADN amplificado que se analizan posteriormente.

Electroforesis

Los fragmentos se analizan mediante técnicas de electroforesis, en las que el ADN migra dentro de una matriz polimérica sometida a un campo eléctrico. En la electroforesis los fragmentos de ADN se separan según su tamaño molecular, originando bandas que pueden compararse con las de un marcador de referencia. En las primeras técnicas de genotipado se observaba un patrón de bandas operfil electroforético característico, específico de cada persona. Las técnicas capilares actuales introducen mayor resolución durante la electroforesis, discriminando entre fragmentos de ADN que se diferencian en tan solo 1 nucleótido.

Multiplexado

Existe una gran variedad de estrategias de PCR que se pueden aplicar al análisis genotípico. El multiplexado permite combinar en una sóla reacción de PCR primers que amplifican varios STRs a la vez. Por contraposición, el singlexado emplea un solo juego de primers para originar un amplicón cada vez. Si el multiplexado de STRs se combina con un marcaje diferencial de los primers con compuestos fluorescentes, en una única reacción de PCR se pueden estudiar incluso 20 marcadores STR a la vez, reduciendo el tiempo de análisis.

Secuenciación

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Aplicaciones


Las técnicas de genotipado se emplean habitualmente para la identificación de personas (huella de ADN o DNA fingerprint) o para el establecimiento de las relaciones de parentesco entre indivíduos mediante un análisis de ligamiento genético. Son especialmente útiles para la realización de test de paternidad, confirmación de maternidad biológica, y estudio de ancestros.


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